Herbisida bekerja dengan mengganggu proses fisiologis dan biokimia gulma melalui zat kimia, yang menyebabkan kematian atau terhambatnya pertumbuhan gulma. Mekanisme kerja herbisida bermacam-macam, terutama sebagai berikut:
1. Gangguan pada fotosintesis: Misalnya, herbisida triazin menghalangi rantai transpor elektron fotosintesis, menyebabkan gulma mati karena tidak dapat mensintesis energi;
2. Penghambatan sintesis asam amino: Misalnya, glifosat menghambat sintase EPSP, menghalangi sintesis asam amino aromatik;
3. Gangguan pembelahan sel: Misalnya herbisida dinitroanilin menghambat pembentukan mikrotubulus, mencegah pembelahan sel;
4. Meniru hormon tanaman: Misalnya, 2,4-D merangsang pertumbuhan secara berlebihan, menyebabkan gulma berubah bentuk dan mati. Selektivitas herbisida bergantung pada perbedaan metabolisme antara tanaman dan gulma; herbisida non-selektif mempunyai efek membunuh pada semua tanaman.
